1. 什么是双特异性纳米抗体

双特异性抗体（Bispecificantibody，BsAb）是1960年Nisonoff 团队首次提出，是一种可以同时结合两种特异性表位或目的物的人工工程化抗体。2009年首个BsAb药物Catumaxomab被欧盟批准上市。

双特异性纳米抗体是指利用基因工程技术对纳米抗体进行人工改造，形成新的双特异性纳米抗体分子，并保持其优异的性能，从而在抗体工程应用领域具有良好的前景。

图1：双特异性纳米抗体

2. 纳米抗体及优点

羊驼是骆驼科的成员，包括美洲驼（Llama）以及我们熟悉的羊驼（Alpaca）。除常规IgG外，驼科动物还产生一种功能性单链抗体，该抗体能够与抗原结合，即为纳米抗体，有时称为VHH抗体。纳米抗体（Nanobody, Nb 晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa。这些抗体仅由重链组成，缺乏轻链和功能性CH1和CH4结构域。这些所谓的重链抗体正被用于开发单域抗体。这些抗体的单结构域性质提供了独特的优势，使其在生物技术应用中脱颖而出。

纳米抗体的优点：

（1）在高温和pH下的稳定性；

（2）VHH可以识别通常不被常规抗体识别的抗原位点；

（3）它们的小分子片段有助于快速组织渗透和标记应用，包括跨越血脑屏障；

（4）用于大规模生产节约成本的替代品。

3. 纳米抗体的制备

相比较传统的单克隆抗体，纳米抗体的制备具有很大优势。可以概括为免疫羊驼获得抗体基因和噬菌体展示来获得目的抗体序列。主要分为羊驼免疫，噬菌体文库构建，筛选抗体库、抗体表达与功能验证四个步骤。

3.1羊驼免疫

挑选适龄羊驼→准备抗原→免疫羊驼→采血测定效价→PBMC细胞分离

3.2 噬菌体文库构建

RNA提取→cDNA反转录合成→PCR扩增→连接载体并电转化→细菌文库/噬菌体文库建立

3.3 抗体库筛选

常规使用的筛选方法是固相筛选，磁珠和细胞筛选，我们可以根据客户需求提供定制化的筛选体系。

3.4 抗体表达与功能验证

构建哺乳表达载体进行表达→过镍柱纯化→亲和力测定

图2：Fc-VHH纳米抗体表达结果图片

4. 双特异性纳米抗体的制备

双特异性抗体制备的方法目前主要有化学偶联法、双杂交瘤融合法、重组基因法。

（1）化学偶联法：原理是通过化学偶联剂（如邻苯二马来酰亚胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸盐、二硫代酰基苯甲酸等）将两个完整IgG或两个F(ab)2抗体片段偶联成一种BsAb，优点是方法操作简单，速度快，缺点是容易致癌。

（2）双杂交瘤融合法：利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞系，然后对特定的抗体进行分离。杂交瘤细胞系制备会让重链-轻链抗体随机结合，因此制备的双特异性抗体具有随机性，效率比较低。

（3）重组基因法：这种方法可以解决双杂交瘤融合法重链-轻链抗体随机结合的问题，是目前最普遍使用的方法。

5. 双特异性纳米抗体构建

 由于纳米抗体只有一个重链可变区，双特异性纳米抗体的设计避免了双抗体制备过程中重链与轻链的错配，从而实现了通用设计，开发了多种设计双特异性抗体的方法。

（1）VHH可组装成双特异性抗体，用于提高抗原结合的特异性，减少脱靶效应，用于同一抗原的不同表位，双特异性抗体可与不同抗原的纳米抗体组合在一起。

（2）为了制备多特异性纳米抗体，双特异性纳米抗体可与其它多肽或蛋白质结合。

（3）FC片段也可用于将VHH与SCFV片段偶联产生双抗，可以增强ADCC或ADCP效应。双特异性纳米抗体可以作为CAR-T疗法中的工具。CAR-T疗法利用基因工程技术，将激活的T细胞安装在定位导航装置CAR(肿瘤嵌合抗原受体)上，将T细胞打造成“超级战士”CAR，能准确、专门地识别和消除体内的肿瘤细胞。 

图3：纳米抗体改造